BioBran - príručka po Slovensky [ PDF súbor, 7 MB ]
  1. Rozhovor s Dr.Mamdoohom Ghoneumom o preparáte BioBran
  2. "Arabinoxylan, BRM alebo biologicky účinný modifikátor, pôsobí proti rakovine a AIDS"
  3. Imúnna stimulácia a prevencia rakoviny
  4. Imunomodulatívne funkcie NK-buniek (prirodzené zabíjače) u 27 pacientov s onkologickými ochoreniami, ktorí užívali výživový doplnok BioBran.
  5. Prípad v ktorom ryžové otruby arabinoxylanu boli použité ako doplnková liečba počas liečby kostných metastáz pri rakovine pľúc.
  6. Efekt MGN-3 na potkany infikované cisplatinou a adriamycinom.
  7. Modulácia NK bunkovej aktivity ako možný spôsob pri liečení rakoviny vaječníkov BioBranom, MGN-3, modifikovanej xylózy z ryžových otrúb.
  8. MGN-3, BioBran - nový protirakovinový prípravok
  9. Mimotelová anti HIV aktivita spôsobená MGN-3 (In Vitro)
  10. Účinok MGN-3, arabinoxylanovej zložky, na sérove lipidy u diabetických potkanov nainfikovaných streptozocinom
  11. Imunomodulačné a antitumorózne vlastnosti BioBranu (MGN-3), modifikovanej xylózy z ryžových otrúb u 5 pacientiek s karcinómom prsníka.
  12. BioBran ako prídavná liečba mnohopočetného myelómu - jeho úloha v aktivácii prirodzených zabíjačov (NK buniek), (kazuistika)
  13. Imunitná obnova NK buniek u pacientov so zhubným ochorením pomocou BioBranu, modifikovaného arabinoxylánu z ryžových otrúb (Štúdia zahŕňajúca 32 pacientov, sledovaných 4 roky)
  14. Aktualizácia výskumu BioBranu
  15. Synergná úloha arabinoxylanu ryžových pliev (MGN-3/Biobran) pri apoptóze monovrstvy buniek rakoviny prsníka MCF-7 navodenej S.cerevisiae
  16. Inhibujúci účinok BioBranu na poruchy fukcie pečene
  17. BioBranom urýchlená maturácia ľudských dendritických buniek, derivovaných z monocytov
  18. Metastatický hemangiopericytóm kože liečený širokou lokálnou excíziou a podporou MGN-3
  19. Protizápalové a imunomodulačné účinky zlúčeniny arabinoxylánu z ryžových otrúb pri syndróme dráždivého čreva
  20. BioBran (MGN-3), Saba-FP a Pro-Knox v integratívnej starostlivosti o pacientov s pokročilým nádorovým ochorením.
  21. Môže štandardizovaný, fakticky podložený rastlinný imunomodulátor (arabinoxlánový koncentrát z ryžových otrúb) synergickým spôsobom zvyšovať účinnosť Gemcitabinu? Prípadová štúdia pacienta s duktálnym karcinómom pankreasu



15. Synergná úloha arabinoxylanu ryžových pliev (MGN-3/Biobran) pri apoptóze monovrstvy buniek rakoviny prsníka MCF-7 navodenej S.cerevisiae
Anticancer research 25: 4187-4196 (2005)
Mamdooh Ghoneum1 a Sastry Gollapudi2
1 Lekárska a vedecká univerzita Charlesa R.Drewa, Oddelenie otolaryngológie, Los Angeles, CA 90059;
2 Kalifornská univerzita, Irvine, Divízia základnej a klinickej imunológie, Irvine, CA 92718, USA


Abstrakt
Nedávno sme preukázali, že v líniách buniek rakoviny prsníka (BCC) po fagocytóze S .cerevisiae dochádza k apoptóze. Ukázalo sa, že extrakt z ryžových pliev s arabinoxylanom (MGN-3/Biobran) tento efekt podporuje. Predchádzajúce údaje pochádzali z pokusov na bunkách v suspenzii, a preto sme podnikli túto štúdiu, ktorej účelom bolo preskúmať monovrstvu BCC, ktorá lepšie modeluje rast rakovinových buniek. Monovrstvy rakovinových buniek prsníka (MCF-7) a nenádorových epitelových buniek prsníka (MCF-10A ) pestovaných na sklenených krycích sklíčkach sme kultivovali s teplom usmrtenými bunkami S .cerevisiae v pomere 1:10. Bunky MCF-7 fagocytovali kvasinky časovo závislým spôsobom – od 6,9% po 1 hodine po 14,3% po 4 hodinách, s dvojnásobným vzostupom rýchlosti v prítomnosti MGN-3. Na druhej strane, bunky MCF-10A prakticky vôbec nefagocytovali kvasinku. Podobne, apoptóza buniek MCF-7 indukovaná kvasinkou bola časovo závislá, od 11.5% po 1 hodine po 21,7% po 4 hodinách a za prítomnosti MGN-3 bola zvýraznená. Tieto údaje môžu mať význam pre terapiu rakoviny prsníka.

Korešpondencia: Mamdooh Ghoneum, Ph.D., Lekárska a vedecká univerzita Charlesa R.Drewa, Oddelenie otolaryngológie, 1621 E. 120th Street, Los Angeles, Kalifornia 90059, USA. Tel.: (323) 563-5953, fax: (310) 668-4554, e-mail: mghoneum@ucla.edu Kľúčové slová: monovrstva buniek MCF-7, apoptóza, fagocytóza, S .cerevisiae, MGN-3

V rámci apoptózy sa odohráva kaskáda biochemických dejov, ktoré sú prísne regulované. K niektorým prvkom tejto kaskády patrí aktivácia špecifických cysteínproteáz, ktoré sa nazývajú kaspázy, uvoľňovanie smrtiacich faktorov z mitochondrií a – nakoniec – fragmentácia DNA (1). Mnohé protirakovinové liečivá pôsobia práve prostredníctvom indukcie apoptózy (2-8). Špecifické medzibunkové poškodenie vyvolané mnohými terapeutickými pôsobkami už bolo charakterizované a ukázalo sa, že postihuje systém Fas/FasL (5), mitochondrie (6) a poškodenie DNA (7,8). Čo sa týka usmrcovania rakovinových buniek imunitnými bunkami, dávnejšie štúdie ukázali, že efektorové lymfocyty, napr. NK a T bunky, používajú na usmrtenie cieľových buniek dve cesty. Prvá cesta využíva ligáciu FasL na jeho receptor Fas, čím sa indukuje apoptóza (9-13). Druhá cesta využíva v indukcii lýzy cieľových buniek proteín performín, ktorý tvorí póry a serínovú proteázu granzým B (14,15). Na druhej strane, nádorové bunky vyvíjajú viaceré stratégie, aby unikli apoptóze indukovanej či už obranným systémom hostiteľského organizmu alebo chemoterapeutickým pôsobkom (16). K týmto stratégiám patria neutralizácia Fas-FasL (17-19), zmenšenie (downregulation) apoptózy sprostredkovanej smrtiacim receptorom, zmeny mitochondriálnej cesty apoptózy a zvýšenie (upregulation) antiapoptotických proteínov (napr. FLIP, IAPs) a proteínov vyvolávajúcich rezistenciu proti viacerým liečivám (20-22). Nádorové bunky dokážu tiež inaktivovať CTL prostredníctvom indukcie apoptózy a sekréciou imunosupresívnych faktorov (23,24). Naviac, rakovinové bunky odvodené z T a B buniek vykazujú fagocytárnu aktivitu voči lymfocytom in vitro (25) a in vivo voči autológnym lymfocytom pacientov trpiacich rakovinou (26,27).
Preto je zvlášť významné hľadať pôsobky, ktoré budú indukovať apoptózu rakovinových buniek s minimálnymi vedľajšími účinkami. Nedávno sme predložili prvý dôkaz pre to, že teplom usmrtené nepatogénne bunky S .cerevisiae, pekárenských a pivovarníckych kvasiniek, indukujú apoptózu buniek rakoviny prsníka (BCC)(28, 29), skvamózneho karcinómu jazyka a adenokarcinómov hrubého čreva (30). V týchto štúdiách boli rakovinové bunky pestované v suspenzii. Keďže BCC rastú v monovrstve, domnievali sme sa, že je zvlášť zaujímavé skúmať: i ) či BCC vychytávajú kvasinky aj ak sa pestujú v monovrstve, ii) či extrakty z ryžových pliev (MGN-3/Biobran) dokážu pôsobiť synergicky na tento apoptotický účinok kvasiniek a iii) či apoptóza indukovaná kvasinkami je selektívna len pre rakovinové bunky. Skúmali sme preto účinky kvasiniek na epitelové bunky prsníka MCF-10A . V tejto štúdii sme zistili, že po adhézii/pohltení kvasiniek dochádza v monovrstve buniek MCF-7 k apoptóze a že tento proces je podporený prítomnosťou MGN-3 a zrejme poukazuje na špecificitu vo vzťahu k rakovinovým bunkám.

Materiál a metódy
Bunkové línie
Použili sme línie buniek rakoviny prsníka človeka MCF-7 a bunkové línie epitelálnych buniek prsníka MCF-10A zakúpené od Americkej zbierky tkanív a kultúr (ATCC), Manassas, VA, USA. Bunky sme uchovávali v našom laboratóriu v kompletnom médiu (CM), ktoré pozostáva z RPMI-1640 s prídavkom 10% fetálneho teľacieho séra (FCS), 2 mM glutamínu a 100 g/ml streptomycínu a penicilínu.
 
Príprava S .cerevisiae.
Použili sme komerčné pekárenské a pivovarnícke kvasinky S .cerevisiae. Kvasinky sme usmrtili teplom inkubáciou počas 1 hodiny pri 90°C., raz premyli a pred podaním resuspendovali vo fyziologickom roztoku pufrovanom fosfátom (PBS). Na kvantifikáciu sme použili hemocytometer a suspenziu buniek sme upravili na 1x107 buniek/ml.
 
MGN-3
MGN-3 je arabinoxylan extrahovaný z ryžových pliev upravených enzymaticky extraktom z huby Shiitake. Obsahuje polysacharidy (1, 3-glukan a aktivovanú hemicelulózu). MGN-3 sme pripravovali čerstvý rozpustením v destilovanej vode v koncentrácii 100 mg/ml. MGN-3 dodala Daiwa Pharmaceuticals Co. Ltd., Tokyo, Japonsko.
 
Rast monovrstvých buniek MCF-7 a MCF-10A na 8-jamkových platniach.
Vyvinuli sme modelový testovací systém na skúmanie apoptózy monovrstvy buniek MCF-7 a MCF-10A po kultivácii s kvasinkami. Systém umožňuje monitorovanie fagocytózy kvasiniek a apoptózy adherujúcimi a neadherujúcimi bunkami MCF-7 a MCF-10A . Pre tento účel sme nechali rásť bunky MCF-7 a MCF-10A na 8-jamkových platniach (veľkosti 26x33 mm) (LUX Scientific Corp., Thousand Oaks, CA, USA). Na dno jednotlivých jamiek sme umiestnili krycie sklíčko. Do každej jamky sme napipetovali 1x105 buniek MCF-7/ml a ponechali, aby priľnuli. Po 2 hodinách sme bunky raz premyli 1 ml CM. Do jamiek sme pridali kvasinky (1x106 buniek v 5 l) s MGN-3 (100 g/ml) alebo bez neho a inkubovali pri 37°C a 5% CO2. V určitých odstupoch v intervale 1 – 4 hodiny sme vyšetrili adherujúce i neadherujúce bunky nasledovne:
Neadherujúce bunky Médium obsahujúce neadherujúce nádorové bunky (1 ml) sme preniesli do skúmaviek. Zo suspenzie buniek sme použili 200 l na prípravu cytospinových preparátov (Shandon Southern Instruments, Sewickly, PA, USA). Preparáty sme fixovali 100% metanolom, nechali osušiť na vzduchu, farbili 4% Giemsovým farbivom po 15 minút (Sigma-Aldrich Corp., St.Louis, MO, USA) a prezerali pod olejovou imerziou svetelným mikroskopom vybaveným objektívom so zväčšením 100x (Nikon, Tokyo, Japonsko). Spočítali sme apoptotické bunky v objeme 200 l a získané číslo sme vynásobili 5, aby sme dostali celkový počet apoptotických neadherujúcich buniek v suspenzii buniek (Z ). Percento apoptotických buniek = Z / celkový počet buniek [100.000]x 100.
Adherujúce bunky Krycie sklíčka s adherujúcimi bunkami sme opatrne vybrali, nechali osušiť na vzduchu, pripevnili na podložné sklíčka a upravili spôsobom popísaným pre neadherujúce bunky. Analyzovali sme percento priľnutia, fagocytózy a apoptózy.
 
Hodnotenie priľnutia a testu na fagocytózu
Monovrstvu adherujúcich buniek MCF-7 a MCF-10A kultivovanú s kvasinkami v prítomnosti MGN-3 alebo bez neho sme použili na stanovenie percenta adhézie. Adhéziu kvasiniek na nádorové bunky sme vypočítali ako percento z 200 nádorových buniek, ktoré mali na sebe jednu alebo viacero kvasiniek. S ohľadom na fagocytózu sme použili inde popísaný test s malými úpravami (31,32). Stručne povedané, kultivovali sme adherujúcu monovrstvu buniek MCF-7 a MCF-10A s kvasinkami v prítomnosti MGN-3 alebo bez neho a stanovili sme počty fagocytujúcich buniek ako je to popísané v (B). Podobne sme počítali aj vychytávanie kvasiniek nádorovými bunkami ako percento z 200 nádorových buniek, ktoré pohltili jednu alebo viacero kvasiniek.
 
Pokusy na potvrdenie fagocytózy
Na zistenie, či naše pozorovania sa skutočne týkajú fagocytózy kvasiniek bunkami MCF-7 alebo či ide o jednoduché priľnutie kvasiniek k rakovinovým bunkám, sme použili tri rôzne pokusy. Boli to nasledovné postupy:
Fluorescenčná mikroskopia: Fagocytózu sme skúmali pomocou kvasiniek označených propidiom jodným (PI). K monovrstve buniek MCF-7 na 8-jamkových platniach sme pridali fluoreskujúce kvasinky v pomere 10:1. Po 2 hodinách sme počítali počet adherujúcich rakovinových buniek, na ktoré priľnuli /ktoré fagocytovali fluoreskujúce kvasinky, a to pomocou fluorescenčného mikroskopu vybaveného objektívom so 100-násobným zväčšením (Nikon). Vplyv nízkej teploty: Na preskúmanie účinku schladenia na fagocytárnu aktivitu buniek MCF-7 sme vykonali súbor pokusov. Pre tento účel sme kultivovali monovrstvu buniek MCF-7 s kvasinkami v pomere 1:10 pri 4°C počas 2 hodín. Následne sme spočítali percento adhézie a fagocytózy na cytospinových preparátoch. Výsledky sme porovnali s počtami buniek kultivovaných s kvasinkami pri 37°C.
Pôsobenie cytochalazínu B: Monovrstvu buniek MCF-7 (2x105 buniek/ml) sme inkubovali s cytochalazínom B (10 g/ml) 1 hodinu pri 37°C. Bunky sme premyli dvakrát PBS a inkubovali s kvasinkami v pomere 1:10 (bunky MCF-7:kvasinky). Po 2 hodinách sme spočítali na cytospinových preparátoch percento adhézie a fagocytózy.
 
Hodnotenie prežívania nádorových buniek a apoptózy.
Bunky v monovrstve sme kultivovali s kvasinkami v pomere 1:10. Vplyv kvasiniek a pridania MGN-3 na prežívanie buniek, apoptózu adherujúcich a neadherujúcich buniek sme skúmali v rôznych časových intervaloch a apoptózu buniek sme hodnotili 4 metódami:
  • Farbenie annexínom V: Bunky MCF-7 sme inkubovali s kvasinkami (v pomere 1:10) alebo bez nich 2 hodiny pri 37°C. Bunky, ktoré sa oddelili od monovrstvy, sme zozbierali, premyli PBS a suspendovali v 100 l nárazníkového roztoku viažuceho annexín V (CalTag Laboratories, Burlingame, CA, USA); 5 l annexínu V označeného FITC sme potom pridali k bunkovej suspenzii a inkubovali v tme pri teplote miestnosti. Po 15 minútach inkubácie sme pridali 400 l nárazníkového roztoku viažuceho annexín V a stanovili sme väzbu annexínu pomocou prietokovej cytometrie. Potom sme odobrali tisíc buniek a analyzovali pomocou softvéru Cell Quest.
  • Analýza pomocou prietokovej cytometrie: Na stanovenie percenta usmrtených neadherujúcich buniek MCF-7 sme použili prietokovú cytometriu. Rakovinové bunky sme kultivovali s bunkami kvasiniek v pomere 1:10 v prítomnosti MGN-3 (100 g/ml) alebo bez neho. Po 4 hodinách sme zozbierali neadherujúce bunky a stanovili sme percento usmrtených buniek pomocou techniky s propidiom jodným (PI) a prietokovej cytometrie. V stručnosti sme postupovali nasledovne: Neadherujúce bunky sme fixovali 70% metanolom, resuspendovali v nárazníkovom roztoku na extrakciu DNA, premyli PBS a inkubovali s 50 g/ml PI 30 minút pri teplote miestnosti v tme. Potom sme analyzovali pomocou FACScanu (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA).
  • Farbenie podľa Giemsa: Apoptóza je morfologicky definovaná zväčšením bunky, tvorbou mechúrikov na membráne a kondenzáciou chromatínmu. Tieto kritériá sme použili na identifikáciu apoptotických adherujúcich buniek MCF-7 a MCF-10A na cytospinových preparátoch farbených podľa Giemsa. Percento apoptotických adherujúcich buniek sme počítali na 10 miestach krycieho sklíčka, ktoré každé obsahovalo po 100 buniek. Na predtým pripravených cytospinových preparátoch ofarbených Giemsovým farbivom sme počítali tiež percento apoptotických neadherujúcich buniek.
  • Farbenie trypanovou modrou: Neadherujúce apoptotické bunky MCF-7 sme ofarbili trypanovou modrou a počítali sme ich pod svetelným mikroskopom a pomocou hemocytometra. Percento usmrtených buniek = % mŕtvych buniek v supernatante/celkový počet buniek [100.000] x 100.
Štatistická analýza.
Na porovnanie priemerov vplyvu 1 (kvasinky) a vplyvu 2 (kombinácia kvasiniek a MGN-3) sme použili analýzu variancie.

Výsledky
 
Štúdie fagocytózy.
Percento priľnutia a fagocytózy: Monovrstvu buniek MCF-7 sme kultivovali s kvasinkami v prítomnosti MGN-3 a bez neho a stanovili sme percento priľnutia a fagocytózy kvasiniek bunkami MCF-7 po 1, 2 a 4 hodinách. Údaje na Obrázku 1A ukazujú, že priľnutie buniek MCF-7 ku kvasinkám vykazovalo časovú závislosť: 13,4% po prvej hodine a 25% po druhej hodine. Pridanie MGN-3 zvýšilo úroveň priľnutia vo všetkých časových intervaloch. Ilustrácia na Obrázku 1B ukazuje kvasinku priľnutú k bunkám MCF-7 za 1 hodinu. Podobne aj fagocytóza kvasiniek bunkami MCF-7 sa zvyšovala s predlžujúcim sa časom: 6,9% po 1. hodine, 14,3% po 4 hodine (Obrázok 2A ). MGN-3 zvýšil v 1. – 4. hodine počet fagocytujúcich buniek 2 – 3-násobne. Ilustrácia na Obrázku 2B ukazuje viacero buniek MCF-7 pohlcujúcich viacero kvasiniek (po 2 hodinách). Všimnite si viacpočetné vakuoly natrávených kvasiniek vo vnútri apoptotických buniek po 4 hodinách (Obrázok 2C). Na druhej strane údaje ukazujú, že na monovrstvu MCF-10A prakticky kvasinky nepriľnuli (3%) ani týmito bunkami neboli fagocytované (1%) (Obrázky 1A , B). Overenie fagocytárnych pokusov: Aby sme odlíšili ciele fagocytózy adherujúce na povrch bunky od skutočne fagocytovaných cieľov, usporiadali sme 3 rôzne druhy pokusov. Fagocytózu sme skúmali pomocou fluoreskujúcich kvasiniek. Skúmali sme počet adherujúcich rakovinových buniek ľnúcich k fluoreskujúcim kvasinkám/fagocytujúcich fluoreskujúce kvasinky. Po 2 hodinách vykazovalo 15% buniek MCF-7 ľnúce kvasinky (Obrázok 3A ) a 11% buniek vykazovalo fagocytárnu aktivitu (Obrázok 3B). Bunky MCF-7 v monovrstve kultivované s kvasinkami pri nízkej teplote (4°C) vykazovali významne nižšiu úroveň fagocytózy (Obrázok 4B). Podobné výsledky sme získali po pôsobení cytochalazínu B na bunky MCF-7; cytochalazín B je známy inhibítor fagocytózy (33,34) (Obrázok 5).
 
Štúdie apoptózy.
Aby sme zistili vplyv kvasiniek a pôsobenia MGN-3 na prežívanie buniek, identifikovali sme adherujúce a neadherujúce apoptotické bunky v rôznych intervaloch a apoptózu rakovinových buniek sme hodnotili pomocou 4 rôznych metód: Farbenie annexínom V : Skúmali sme, či kvasinky navodia apoptózu v monovrstve buniek MCF-7. Pre tento účel sme kultivovali rakovinové bunky 2 hodiny s kvasinkami v pomere 1:10 a stanovili sme pomocou farbenia annexínom V počet apoptotických neadherujúcich buniek MCF-7. Údaje na Obrázku 6 ukazujú, že kultivácia buniek MCF-7 s kvasinkami viedla k významnému zvýšeniu počtov apoptotických buniek (36,1% v porovnaní s 6,4% u kontrolných neovplyvnených buniek). Analýza pomocou prietokovej cytometrie: Pomocou prietokovej cytometrie sme skúmali prežívanie buniek MCF-7 po 4 hodinách ovplyvnenia kvasinkami, MGN-3 resp. kvasinkami + MGN-3. Výsledky ilustrované na Obrázku 7 ukazujú významné zvýšenie apoptózy neadherujúcich buniek MCF-7 po ovplyvnení MGN-3 (58% usmrtených buniek v porovnaní s 9,5% u kontrol). Samotné kvasinky tiež vyvolali významné zvýšenie bunkovej smrti (85%) v porovnaní s neovplyvnenými. Vplyv kvasiniek za prítomnosti MGN-3 zvýšil apoptózu nádorových buniek ešte viac (92%). Farbenie podľa Giemsa: Apoptóza je morfologicky definovaná ako zväčšenie buniek, objavenie sa mechúrikov na membráne a kondenzácia chromatínu. Tieto kritériá sme použili na identifikáciu apoptotických buniek MCF-7 a MCF-10A na cytospinových preparátoch zafarbených Giemsovým farbivom. Bunky MCF-7 vykazovali po kultivácii s kvasinkami apoptózu a pozorovali sme ju u adherujúcich buniek. Údaje na Obrázku 8A ukazujú 5,6% adherujúcich buniek postihnutých 1 hodinu po kultivácii s kvasinkami apoptózou a zvýšenie na 10,7% po 4 hodinách. Pridaním MGN-3 sa percento apoptotických buniek po 1 – 4 hodinách zvýšilo. Apoptózu sme skúmali tiež u neadherujúcich buniek (Obrázok 8B). Cytospinové preparáty vykázali zvyšovanie apoptózy so zvyšujúcim sa časom. Pridanie MGN-3 spôsobilo 2-násobný vzostup percenta apoptotických buniek vo všetkých časových intervaloch. Keď spojíme údaje o apoptotických adherujúcich bunkách s údajmi o neadherujúcich bunkách, vidíme významnú apoptózu (Obrázok 8C): 11,5% po 1 hodine a 21,7% po 4 hodinách. MGN-3 zvýšil apoptózu o 207% po 1. hodine a o 134% po 4. hodine. Na rozdiel od toho, zvýšenie apoptózy dosiahnuté u neadherujúcich buniek MCF-10A po kultivácii s kvasinkami bolo iba 0,2%. Obrázky 9A -I ilustrujú morfologické zmeny rakovinových buniek po kvasinkami navodenej apoptóze. Apoptotické zmeny navodené niekoľkými alebo množstvo kvasiniek sa zaznamenali po rôznych intervaloch kultivácie rakovinových buniek s kvasinkami. Medzi neadherujúcimi i adherujúcimi bunkami boli po 4 hodinách zaznamenané apoptotické bunky MCF-7 s kondenzáciou chromatínu. Na preparátoch sa objavili aj apoptotické bunky s fragmentovanou DNA. Za tým nasledovalo vytvorenie mechúrikov na membráne a prítomnosť fragmentov jadra vo vnútri mechúrikov. Možno si všimnúť viacpočetné vakuoly pohltených a natrávených kvasiniek. Nakoniec vymizne jadro a bunky sa sfarbia trypanovou modrou. Farbenie trypanovou modrou: Na neadherujúce bunky MCF-7 sme pôsobili trypanovou modrou a počítali sme sfarbené bunky pomocou prietokovej cytometrie. Na Obrázku 10 vidno, že kvasinky spôsobili apoptózu buniek MCF-7, ktorá sa zintenzívňovala s pribúdajúcim časom a bola maximálna po 4 hodinách (17%). Pridanie MGN-3 zosilnilo apoptotický účinok kvasiniek – zosilnenie apoptotického účinku po 4 hodinách bolo o 182%. Na druhej strane 1 – 4 hodiny po kultivácii s kvasinkami stúpla apoptóza neadherujúcich buniek MCF-10A iba o 0,2%.
 
Diskusia
Neoplastické bunky si vytvárajú rôznu stratégiu úniku spod imunitného dohľadu a chemoterapie. Súčasná štúdia mala za úlohu preskúmať apoptotické účinky S . cerevisiae na monovrstvu BCC, čo je model presnejšie kopírujúci rast rakovinových buniek. Údaje ukázali, že bunky MCF-7 v monovrstve fagocytujú S . cerevisiae. Výsledky potvrdené fluorescenčnou mikroskopiou, ovplyvnenie cytochalazínom B a nízkou teplotou vylúčili možnosť nešpecifickej adhézie ako príčiny tohto pozorovania. Výsledky tiež preukázali, že S .cerevisiae je silný induktor apoptózy buniek MCF-7 rastúcich v monovrstve, ako to ukázalo farbenie annexínom V a prietoková cytometria. Morfologická analýza pomocou farbenia podľa Giemsa preukázala prítomnosť mnohopočetných vakuol v pohltených a natrávených kvasinkách vo vnútri apoptotických rakovinových buniek. Chýbanie dôkazov pre špecificitu apoptotického účinku selektívne pre rakovinové bunky nás viedlo k tomu, aby sme preskúmali účinky S . cerevisiae na netumorogénne bunky MCF-10A získané z ľudského fibrocystického tkaniva prsníka (35). Na rozdiel od toho, bunky MCF-7 z adenokarcinómu prsníka človeka pôsobili tumorigénne na beztýmusové holé myši (36-38). V tejto práci sme preukázali, že bunky MCF-7 rastúce v monovrstve fagocytujú kvasinky a sú postihnuté apoptózou, zatiaľ čo bunky MCF-10A rastúce v monovrstve nevykazujú prakticky žiadnu fagocytózu ani kvasinkami navodenú apoptózu. Apoptotické procesy závisia na malígnom charaktere buniek, pretože sa zdá, že netumorigénne bunky rastúce v monovrstve sú odolnejšie voči kvasinkami navodenej apoptóze. To dokazuje, že normálne bunky nefagocytujú a získavajú schopnosť fagocytovať následne počas transformácie na rakovinové bunky. Možným vysvetlením je, že rakovinové bunky exprimujú povrchové receptory pre adhéziu/fagocytózu, ktoré sa v priebehu malignity exponujú, pričom u netransformovaných buniek ostávajú normálne maskované. Táto i predchádzajúce štúdie (28,29,39) ukázali výrazný rozdiel v úrovni fagocytózy a kvasinkami navodenej apoptózy medzi suspendovanými bunkami MCF-7 a týmito bunkami rastúcimi v monovrstve. Bunky v suspenzii pripravené trypsinizáciou vykázali silnejšiu schopnosť fagocytovať a podliehať apoptóze v porovnaní s bunkami v monovrstve. Trypsín stimuluje adhéziu ľudských buniek karcinómu žalúdka závislú na 51 integríne (40), receptory M2 receptory integrínu na myeloidných bunkách sprostredkujú fagocytózu rôznych ligandov vrátane schladených trombocytov (41,42) a neopsonizovaných patogénov (43). Keďže bunky MCF-7 majú na svojom povrchu M2 receptory integrínu (44,45), je možné, že trypsín stimuluje integrínové receptory buniek MCF-7, ktoré sprostredkujú fagocytózu S .cerevisiae. Apoptotický účinok kvasiniek je špecifický pre nádorové bunky, jeho mechanizmus však nie je jasný. Preukázali sme, že v kvasinkami navodenej apoptóze buniek adenokarcinómu hrubého čreva môžu hrať úlohu kaspázy (30), apoptóza buniek rakoviny prsníka je však pravdepodobne sprostredkovaná mechanizmom, ktorý nemá nič spoločné s kaspázami (39). MGN-3 je arabinoxylan extrahovaný z ryžových pliev (46) a je dokázané, že je to silný pôsobok, ktorý moduluje biologické reakcie (BRM) a ktorý má schopnosť stimulovať funkciu NK buniek (47,48), T a B buniek (46) a makrofágov (49). Okrem imunomodulačného pôsobenia sme preukázali, že MGN-3 zvyšoval kvasinkami navodenú apoptózu buniek MCF-7 rastúcich v monovrstve. Toto zistenie spolu s našimi predchádzajúcimi výsledkami poukazuje na to, že MGN-3 snáď prispieva k expozícii receptorov, ktoré sú zaangažované do adhézie / fagocytózy. MGN-3 scitlivuje ľudské leukemické bunky HUT voči apoptóze navodenej CD95 tým, že znižuje expresiu Bc12 (50). Je možné, že MGN-3 účinkuje podobným mechanizmom na bunky MCF-7. Objasnenie presného mechanizmu účinku MGN-3 na posilnenie kvasinkami navodenej apoptózy si vyžaduje ďalšie štúdie. Táto štúdia potvrdila naše predchádzajúce pozorovania, že v bunkách ľudskej rakoviny prsníka, jazyka a hrubého čreva po fagocytóze teplom usmrtených S .cerevisiae in vitro prebehne apoptóza. Nevieme o žiadnych klinických skúškach, ktoré by skúmali účinnosť kvasiniek proti rakovine. Testy so selenizovanými kvasinkami ako chemopreventívnym pôsobkom však boli realizované v rámci viacerých klinických štúdií rakoviny (51-53), ktoré skúmali účinok každodenného podávania selénu ako prostriedku proti rakovine. Identifikácia účinnej zložky (zložiek) kvasiniek, ktorá navodzuje apoptózu, by mohla vyústiť do terapeutického prístupu k vývoju lieku proti rakovine. Špecificita a bezpečnosť teplom usmrtených kvasiniek a MGN-3 je výhodou v porovnaní so súčasne dostupnými protirakovinovými liekmi, a môže sa stať základom štúdií in vivo s významnými terapeutickými dôsledkami.


Poďakovanie
Sme veľmi vďační Dr.Jamalovi Abedimu, profesorovi štatistiky na Kalifornskej univerzite v Los Angeles, Katedra vzdelávania, divízia metodiky sociálneho výskumu, USA, za pomoc pri štatistických analýzach. Autori by chceli poďakovať aj Daiwa Pharmaceutical Co., Tokyo, Japonsko, za finančnú podporu tohto projektu.
      na začiatok stránky
Imunotop s.r.o.; Račianské mýto 1/B; 831 02 Bratislava; tel.: 02 / 4463 5707; fax: 02 / 4463 5708; e-mail: imunotop@imunotop.sk
Design & code by Dusan Tudik - T&T WebDesign
hosted by Yegon